Elizabeth Holmes sinh vào tháng 2 năm 1984 tại Washington, D.C.. Cha bà, Christian Holmes IV, đã làm việc ở Hoa Kỳ, Phi Châu và Trung Quốc cho các cơ quan chính phủ như USAID. Mẹ bà, Noel Anne (Daoust),[9] là nhân viên của quốc hội. Bà có một người anh em, Christian Holmes V, mà là giám đốc quản lý sản phẩm tại Theranos. Một trong những tổ tiên của bà cũng là đồng sáng lập viên của công ty Fleischmann's Yeast.[10]

Holmes nhập học ở trường ST.John's tại Houston. Trong lúc học tại trường này, Bà có niềm yêu thích với việc lập trình máy tính và nó đã giúp bà bắt đầu việc kinh doanh đầu tiên của mình là bán các bản lập trình C++ cho các trường đại học ở Trung Quốc.